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Los compuestos cloroaromáticos corresponden en muchos casos a herbicidas de uso agrícola, como el 2,4-D y otros herbicidas fenoxialcanoicos, y los del tipo s-triazina, como la atrazina y la simazina.

En nuestro laboratorio, usando microcosmos preparados con suelos, hemos estudiados distintos aspectos de la biorremediación de estos herbicidas cloroaromáticos, tales como:

Rol de la microbiota eucarionte del suelo en la sobrevida y eficiencia de las capacidades catabólicas de la bacteria degradadora Cupriavidus necator JMP134

C. necator JMP134 es una bacteria muy estudiada por su capacidad de degradar de compuestos cloroaromáticos, sin embargo ha sido poco explorada en su capacidad de biorremediar suelos contaminados . Es por esto que decidimos explorar las capacidades degradativas de esta cepa en microcosmos de suelo contaminado con 2,4-D.

¿Cuál es la capacidad que tiene Cupriavidus necator JMP134 de degradar 2,4-D en suelo?

Degradación de 2,4-D en microcosmos

Al introducir la cepa JMP134 en un suelo contaminado con 2,4-D, la velocidad de degradación del compuesto aumentaba levemente en relación al suelo nativo. Sin embargo en un suelo previamente esterilizado la degradación del compuesto ocurría rápidamente , indicando que la microbiota nativa limita la expresión capacidad degradadora de la cepa.

¿Cómo es la sobrevida de C.necator JMP134 y de otras bacterias al introducirlas en suelo nativo sin microbiota eucarionte?

Exploramos el rol de la fracción eucarionte pretratando el suelo nativo con cicloheximida, toxico especifico para eucariontes y medimos la sobrevida de la cepa JMP134 y de otras dos cepas de laboratorio en este suelo.

Sobrevida de inóculos bacterianos en suelos

Observamos para todas las cepas un aumento notable en la sobrevida al eliminarla fraccion eucarionte del suelo.

¿Qué poblaciones eucariontes podían verse beneficiadas con la introducción de la cepa JMP134 en suelo?

Adicionamos la cepa reiteradamente en suelo, luego tomamos el sobrenadarte y lo seguimos traspasando en cultivos de JMP134 y obtuvimos una población homogénea de un protozoo ciliado , la secuenciación de su 18S RNA dio un 95% de identidad con la especie protozoo ciliado colpodido formador de cadena.

Genes tfdA y degradación de herbicidas fenoxialcanoicos

Durante más de 50 años los herbicidas fenoxialcanoicos como el 2,4-D han sido ocupados a lo largo del mundo para controlar la maleza de hoja ancha (dicotiledóneas). El primer paso en la degradación de estos herbicidas es llevado a cabo por la enzima 2,4-D dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato, la cual reconoce como sustrato no solo al 2,4-D, sino también otros compuestos fenoxialcanoicos como MCPA, 2,4-DB, Mecoprop y PA (figura 1).

Degradación de herbicidas - 2,4-D dioxigenasa

Figura 1: reacción total de la enzima 2,4-D dioxigenasa dependiente de α-cetoglutarato

En el laboratorio analizamos la diversidad del gen tfdA, el cual codifica para esta enzima. Para ello utilizamos microcosmos preparados con suelo agrícola proveniente de una plantación de paltos de Quillota, V Región, los cuales fueron tratados de manera continua con distintos herbicidas fenoxialcanoicos (figura 2).

Herbicidas fenoxialcanoicos

Figura 2: herbicidas fenoxialcanoicos usados en este trabajo. Se usó también agua como control de incubación, ácido benzoico y ácido cinámico como control de incubación con compuestos aromáticos presentes en la naturaleza, y una mezcla de 2,4-D + Mecoprop + 2,4-DB como tratamiento más fuerte.

Luego de 4 meses de exposición continua a estos compuestos se extrajo el ADN metagenómico para analizar:

  1. presencia y diversidad de genes tfdA mediante PCR con partidores degenerados, clonamiento y secuenciación
  2. distribución de genes tfdA like en cada tratamiento mediante T-RFLP con los partidores degenerados para tfdA
  3. efectos sobre la comunidad microbiana mediante T-RFLP del gen 16S rRNA.

Actualmente se está trabajando con secuencias tfdA like más largas (630 pb vs 360 pb de la primera parte del trabajo) para comparar con mayor precisión las secuencias encontradas en este trabajo con los tfdAs ya descritos. A nivel de secuencia de aminoácidos, analizamos la presencia de residuos importantes en el sitio activo de la enzima, y a nivel de estructura de la proteína, vemos la conservación general de esta estructura y las posibles variaciones en el sitio activo que puedan relacionarse a los sustratos entregados en cada tratamiento. (figura 3)

Mapeo de secuencias tfdA

Figura 3: Panel superior: mapeo de las secuencias TfdA-like en la estructura de la proteína homóloga TauD. En rojo se muestra la secuencia TfdA obtenida con el primer par de partidores y en azul la región adicional que se obtiene con los nuevos partidores. En verde se muestra el sustrato (taurina) ubicado en su sitio de unión, el co-sustrato α-cetoglutarato se muestra en amarillo y el Fe, esencial para la catálisis, se muestra en naranja. Panel inferior: secuencia linear de la proteína TfdA. Los colores rojo y verde corresponden a las regiones descritas en el panel superior. En verde se muestra la posición de los residuos involucrados en la unión al sustrato, y en amarillo los de unión al co-sustrato y al Fe. (Dunning Hotopp & Hausinger, 2002)

Genes atz y degradación de s-triazinas

Plásmido pADP-1

Atrazina y simazina son herbicidas del tipo s-triazinas que actúan por inhibición del transporte de electrones en la fotosíntesis. Su persistencia en suelos y los posibles riesgos para la salud motivan la investigación en su biodegradación.

Se han descrito cepas bacterianas capaces de degradar estos herbicidas. Pseudomonas sp. ADP (pADP-1) degrada atrazina a través de la vía mostrada en la figura. Los genes involucrados en estas vías metabólicas están codificados en el plásmido pADP-1 (Ralebitso et al, 2002; Wackett et al, 2002).

Degradación de atrazina

En nuestro laboratorio realizamos estudios de biodegradación con suelos de una plantación de paltos que habían sido tratados por 10 años con el herbicida simazina y suelos no agrícolas tomados de la misma zona (Quillota, V región). Con experimentos en microcosmos, encontramos que los suelos que habían sido previamente tratados con el herbicida  habían adquirido un potencial de biodegradación. En los microcosmos preparados con estos suelos, en 60 días el 97% de la simazina agregada había sido degradado, mientras que el suelo no agrícola usado como control, sólo degradó un 36% del herbicida en el mismo período.

 

Degradación de simazina en suelos
Degradación de simazina en microcosmos de suelos

También ensayamos el efecto de la bioaumentación con la cepa degradadota Pseudomonas sp. APD (pADP-1) en microcosmos preparados con el suelo tratado. Aunque se detectaron tasas de degradación mayores, después de 4 semanas las concentraciones de herbicida residual eran similares a las de los microcosmos no inoculados.

La estimación del número de copias del gen atzA se realizó por medio de una semicuantificación con PCR competitivo. Con esto encontramos que en el día 0, el número de copias del microcosmo inoculado con la cepa ADP era el esperado para la cantidad de inóculo, mientras que en el suelo no inoculado el número de copias estaba debajo del límite de detección. Pero a los 14 días, los microcosmos inoculados y no inoculados tenían un número similar de copias del gen atzA. A los 28 días, cuando la mayor parte del herbicida había sido degradada, no se detectó el gen.

Detección del gen atzA en suelos

El análisis de las comunidades bacterianas en los microcosmos se realizó por T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism). Con esto se encontró que las comunidades microbianas de los suelos eran afectadas por el agregado de simazina, y que la cepa inoculada no podia detectarse a los 14 días de incubación.

Nuestros estudios indican que para remover simazina de suelos en las concentraciones aplicadas en el campo, la bioaumentación no sería necesaria si el suelo presenta un historial de aplicación del herbicida. Sin embargo la bioaumentación sería recomendable si se quisieran degradar concentraciones mayores, como en el caso de derrames de herbicidas para impedir su transferencia a los cursos de agua.

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